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聚丙烯酰胺凝膠電泳原理和需要注意的地方

時間:2022-04-13 11:11:36來源:本站 作者:admin 點擊:

  聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱PAGE(聚丙烯酰胺?凝膠?聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種常用的以聚丙烯酰胺凝膠為支撐介質的電泳技術。以單體丙烯酰胺和亞甲基二丙烯酰胺為原料,通過聚合反應合成了聚丙烯酰胺凝膠。聚合過程是由自由基催化的。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理和需要注意的地方

  聚丙烯酰胺凝膠電泳:

  用于分離蛋白質和寡核苷酸。

  聚丙烯酰胺凝膠電泳原理:

  催化聚合有兩種常用方法:化學聚合和光聚合。化學聚合通常是在催化劑過硫酸銨(AP)和促進劑四亞甲基二胺(TEMED)的作用下,四亞甲基二胺催化過硫酸銨產生自由基。溶液的pH值對聚合反應很重要,因為過低的pH值將沒有足夠的堿來加速催化反應,過多的氧分子將很快停止聚合反應。因此,要制成凝膠,必須在加入過硫酸銨之前排出混合物中的空氣。核黃素催化聚合通常用于生產濃縮凝膠,因為得到的凝膠具有較大的孔隙率。核黃素在光照和微量氧存在下產生自由基使ACR聚合。

  聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和亞甲基二丙烯酰胺的濃度來控制,其濃度可以在3%到30%之間。低濃度凝膠具有較大的孔徑,如3%聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有明顯的阻斷作用,可用于平板等電聚焦或SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中的濃縮凝膠,也可用于DNA分離;高濃度凝膠具有較小的孔徑,可作為蛋白質的分子篩。它們可以在電泳中根據分子量分離蛋白質。例如,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳常用10%-20%的凝膠作為分離凝膠。選擇T和C的經驗公式為:C=6.5-0.3T。該公式可用于計算T為5%~20%時的凝膠組成。C值不是很嚴格,在大多數情況下,可以改變1%左右的范圍,當C不變時,凝膠的有效孔徑隨著T的增大而減小,T保持不變,當C為4%時,有效孔徑小,C大于或小于4%,有效孔徑較大,C大于5%時凝膠易碎,不利于使用。實驗中常用的C值分別為2.6%和3%。

  聚丙烯酰胺凝膠的優點:

  1.可隨意控制凝膠濃度“T”和交聯度“C”,從而獲得不同分子量的生物大分子分離所需的不同有效孔徑x%的

  2、可以將分子篩作用和電荷效應結合在一起,在同一方法中,達到更高的靈敏度:10-9~10-12mol/L。

  3.由于聚丙烯酰胺凝膠是由a-C-C-鍵結合的酰胺聚合物,側鏈只有一個不活潑的酰胺基-Co-NH2,沒有帶電荷的其他離子基。它在化學上是惰性的,當電泳發生時不會產生“電滲”。

  4.電泳分離可生產高純度單體原料,重復性好。

  5、透明度好,便于拍照和復印。機械強度好,彈性好,不易破碎,操作和存放方便。

  無紫外吸收,無染色,可用紫外波長凝膠掃描進行定量分析。

  7.也可用作固定酶的惰性載體。

  聚丙烯酰胺凝膠電泳體系有連續體系和間斷體系兩種。前者意味著整個電泳系統所用的緩沖液組成、pH值和凝膠篩孔都是相同的。后者是指在電泳系統中使用兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑。根據電泳設備的不同,可分為垂直管(盤)電泳和垂直板電泳。兩種電泳方法基本相同,只是用于凝膠的支架不是玻璃管就是玻璃板。以不連續體系中的管盤電泳為例,闡述了凝膠分離蛋白質的機理。

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